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化学品蚯蚓急性毒性试验GB/T 21809-2008

一、目的与要求

（1）学习和掌握滤纸接触毒性实验和人工土壤实验的基本原理和方法。

（2）初步了解评价环境中化学物质对土壤中动物急性伤害的标准和基本步骤。

二、原理

蚯蚓是分布广泛的土壤动物，在温带土壤无脊椎动物中其生物量大，是土壤生态系统的一个重要组成部分。赤子爱胜蚓与其它蚯蚓相比，它的抗寒性和耐热性较好，因此是国内外进行毒性试验常用的品种。

本实验包括两部分：滤纸接触法毒性实验和人工土壤实验。滤纸接触毒性实验简单易行，可对受试物毒性进行初筛。将蚯蚓与湿润的滤纸上的受试物接触，测定土壤中受试物对蚯蚓的潜在影响。人工土壤实验系统将蚯蚓置于含不同浓度受试物的人工土壤中，饲养7d和14d，评价其死亡率，评价受试物对蚯蚓的急性毒性作用。   

三、设备与材料

1．主要仪器和设备   

（1）玻璃容器：1 L敞口玻璃标本瓶和平底玻璃管（3 cm×8 cm）

（2）培养装置：光强400～800 lx的温控培养箱（或房间）

（3）中性滤纸：80～85 g/m2

（4）移液管或微量移液器

（5）塑料薄膜或待有通气孔的塞子

（6）烘箱

（7）电吹风

2．试验生物

选用二月龄以上，体重300～500 mg左右的健康赤子爱胜蚓。实验前应在实验室条件下驯养两周以上。

3．人工土壤

人工土壤基质组成（干重）：

（1）10％干牛粪（pH为5.5～6.0，磨细，风干，测定含水量）。

（2）20%高岭黏土（含有50％以上高岭土）。

（3）70％石英沙（0.05～0.2 mm粒径的石英沙颗粒在50％以上）。

（4）混合人工土壤的组成成分，加入蒸馏水使其含水量为干重的25％～42％，混合均匀。

四、方法和步骤

1．清肠

在白磁盘上铺一层湿润的滤纸，将受试蚯蚓置于磁盘上清肠24 h，以排出肠内的内含物。实验正式开始前，用去离子水冲洗蚯蚓，滤纸吸干并称重，供试验使用。

2．滤纸实验

采用长8 cm、直径3 cm的平底玻璃管。玻璃管内壁衬铺滤纸，滤纸大小应合适，以铺满管壁而不重叠为宜。

在正式实验前进行浓度范围选择的预试验，其浓度设计如下：

选择浓度范围的预试验

受试物在滤纸的沉积量（mg/cm2） 受试物浓度（g/mL）

受试物溶于水（溶解度≥1000 mg/L）等助溶剂，配成系列浓度。用移液管或移液器吸取1 mL受试物溶液加入玻璃管，用过滤的压缩空气吹干。对照用1 mL的去离子水或有机助溶剂处理。后在每一玻璃管内均匀地加入1 mL去离子水以湿润滤纸，用留有通气孔的塞子或塑料薄膜封住玻璃管口。

实验中应设至少5个浓度梯度组及空白对照，浓度范围应包括使生物无死亡发生和全部死亡的两组浓度。每一处理至少设10个重复，每一玻璃管只能放置1条蚯蚓。实验在黑暗条件下进行，温度控制在（20±2）℃，实验进行时间为48 h。分别在24 h和48 h观察记录蚯蚓死亡情况，判断蚯蚓死亡的标准是蚯蚓的前尾部对轻微的机械刺激没有反应。同时观测蚯蚓的病理症状和行为。

3．人工土壤实验

在正式实验前，一般需进行浓度范围选择实验。浓度梯度应以几何级数设计，如 0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、1.0 mg/kg、10 mg/kg、100 mg/kg和 1000 mg/kg（人工土壤的干重）。正式实验应设至少5个浓度梯度组及空白对照，浓度范围应包括使生物无死亡发生和全部死亡的两组浓度，每一处理组应有4个平行。

受试蚯蚓在用于实验前需在人工土壤环境中饲养24 h，并在实验前冲洗干净。    将受试物溶于去离子水，然后与人工土壤混合，倘若受试物不溶于水，可用等有机助溶剂溶解，若受试物既不溶于水又不溶于有机溶剂，可将一定量的受试物与石英砂混合，其总量为10 g，然后在试验容器内与990 g（湿重）的人工土壤混合。在每一1 L玻璃标本瓶中加入1 kg（湿重）的实验介质和10条蚯蚓。用塑料薄膜扎好瓶口。将标本瓶置于（20±2）℃、湿度80％的条件下培养，并提供连续光照，以保证实验期间蚯蚓生活在实验介质中。

实验共进行14 d。在第7 d及第14 d，将标本瓶中的实验介质轻轻倒入一白磁盘，取出蚯蚓，检验蚯蚓前尾部对机械刺激的反应。

实验结束时，测定和报告实验介质中的含水量。

4．质量控制

为确证实验系统的灵敏性，可在实验中加入阳性对照组。推荐分析纯氯乙酰胺作为阳性对照参考物质。

实验结束时空白对照组蚯蚓的死亡率不能超过10％。

五、结果和报告

1．结果处理

根据受试物处理浓度和死亡率数据，计算LC50和置信限。

 

六、注意事项

（1）牛粪在与其他人工土壤组成成分混合前应充分磨细风干。并需在105℃条件下烘干称重，测定其含水量。

（2）蚯蚓养殖条件：温度18～22℃，持续光照（强度：400～800 Lux）；孵化箱为深度至少为15 cm，容积10～20 L的容器。蚯蚓驯养过程中应保持湿度，并尽量减少震动。

（3）实验中玻璃管或标本瓶口必须扎紧