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【猪译馆】猪感染非洲猪瘟后带毒多久？（上）
非洲猪瘟持续成为全球养猪业的关注重点，但导致该疾病长期存在的因素及其传播动力学还远未得到了解。一直以来，临床康复猪被认为是疾病长期存在的重要原因之一，这些猪被称为“沉默的携带者”（Allaway, Chinombo, Edelsten, Hutchings, & Sumption, 1995; Boinas, Hutchings, Dixon, & Wilkinson, 2004; Sanchez-Vizcaino, Mur, & Martinez-Lopez, 2012）。然而，针对评估ASF带毒状态的报告非常少，而且常常是高度矛盾的。由于对幸存动物的长期实验代价高昂，并且极难进行，因此这方面的数据极其有限。
本文整理了来自德国因塞尔里姆斯弗里德里希-洛弗勒研究所的一份针对猪ASFV带毒状态的研究报告，实验用了36头猪，历时165天，得到了一个明确的结果：阴性哨兵猪与实验感染猪在感染后99天混栏没有转阳，实验感染存活的猪组织中也没有分离到病毒，表明存活下来的感染猪并不会长期带毒，而是随着时间的推移，病毒载量逐渐降低，并最后完全清除病毒。这一结果也与之前的几项研究结果一致。
猪感染非洲猪瘟后能带毒多久？（上）
作者
A. Petrov | J. H. Forth | L. Zani | M. Beer | S. Blome
作者均是来自德国因塞尔里姆斯弗里德里希-洛弗勒研究所诊断病毒学研究室和传染病研究室的研究人员
实验背景
本研究使用了更多的动物和更长的时间来重新评估康复猪的长期感染和可能的带毒状态。由于东欧II型分离株感染后无法预期会有相当数量的恢复动物，因此使用了来自荷兰的一种中等毒力的ASFV分离株（荷兰86株）作为模型病毒。1986年发生在海牙附近的首次爆发中，这种ASFV毒株在21天内造成一个猪场19%的死亡率（Terpstra & Wensvoort, 1986）。该病毒已被用于传播和发病机制研究（de Carvalho Ferreira, Weesendorp, Quak, Stegeman, & Loeffen, 2014; de Carvalho Ferreira et al., 2012, 2013），因此，有重要的背景数据支持。
实验方法
1实验设计
这个长期的动物实验包括两个步骤：首先，用中等毒力的荷兰86株对猪进行感染（潜在的带毒猪，以下称为C猪）。然后，将健康猪（哨兵猪，以下称S猪）暴露给存活的C猪。本实验一共选用了36头5 ~ 6月龄的杂交家猪，其中30头为C猪，6头为S猪，感染后约3个月混合饲养（感染后99天）。
所有的动物在到达弗里德里希-洛弗勒研究所(FLI)时都打了个体耳标。实验遵守所有适用的动物福利法规，包括欧盟2010/63/EC指令。本实验在高度生物安全的实验条件下进行，主管当局参考批号为LALLF 7221.3 - 1 - 021/15。
实验开始时，所有C猪被分成三组，每组10头，分别饲养在同一个单元的3个独立的大栏里。在适应期出现急性跛行的猪，用磺甲比林500 mg/ml（Medistar, Arzneimittelvertrieb GmbH, Ascheberg, Germany）连续治疗3天。
适应期结束后，所有的C猪各用2毫升含有2×104HAU的荷兰86株ASFV的细胞培养上清液用滴鼻的方式进行感染。在感染前，已证实这些猪体内无ASFV及相关抗体。在试验过程中，每天记录直肠体温和临床症状。至少连续两天体温≥40.0°C即视为发烧。临床症状的评估是基于Mittelholzer、Moser、Tratschin和Hof- mann(2000)的评分系统，包括活力、行动举止、呼吸、步态、皮肤、眼睛、粪便和采食量作为重要参数（分值从0分（无症状）到3分（严重）。各项的总分作为临床评分，若临床总分≥14或出现无法辨明的病情，这些猪就会被实施安乐死。用替莱他明-唑拉西泮（tiletamine/zolazepam, Zoletil®舒泰，Virbac法国维克）和二甲苯胺噻嗪（Rompun® 2%隆朋，Bayer德国拜耳）深度麻醉后，使用乙甲丁酰胺（T61, Merck德国默克）心内注射进行安乐死。
为了评估病毒血症、散毒和免疫应答的水平，在感染前和感染后第3、7、10、14、20、29、42、48、63和91天分别从颈静脉抽取血液样本（EDTA抗凝血样本和血清样本）。同时，采集粪拭子和两种口腔拭子（通常用于口腔浅表的常规口腔试子，和从口咽部较深处采集的唾液试子）。感染后105天到126天，试子每星期取样一次。
感染后第99天，存活的C猪（19头）被重新混群（以获得均匀的分布），同时6头S猪也被混入其中（每组2头），这6头S猪在暴露于C猪前也没有ASFV和相关抗体。在暴露开始后的28天内，用与上述类似的方法对这些猪进行四次临床评估和采样，时间分别为感染后的第105、112、119和126 天。随后，实验措施集中在临床观察和必要时的病理形态学研究。
本实验在C猪感染后的第164/165天结束。此时存活的猪全部通过电击和放血屠杀。并对所有参与实验的猪进行解剖取样，采集的组织样本包括扁桃体、唾液腺、脾脏、肺和下颌淋巴结。对于临床恢复的C猪和所有的S猪，还采集了多处淋巴结样本，包括肺，腹股沟，空肠，结肠，胃肝，肾，腮腺和腘窝。此外，还采集了几头猪的下颌下淋巴结和卵巢样本。并从一头意外怀孕的母猪（S猪）身上收集了11个胎儿的脾脏样本。
2细胞和病毒
本试验用来自外周血单核细胞(PBMCs)的原发性巨噬细胞进行病毒学和血清学研究。
实验使用的荷兰86株可以被认为是I型，最初是在1986年荷兰爆发期间分离出来的（Terpstra & Wensvoort, 1986）。用细胞培养液将含病毒的细胞培养上清液稀释至滴度为2×104HAU，用于实验接种。用外周血单核细胞终点病毒滴定法测定接种剂量。
实验室研究
1样本处理
所有试子均用1ml无血清细胞培养液浸泡，在强涡旋/挤压作用下，室温孵育1小时。然后，将标准的口腔拭子和粪拭子倒进微离心管中，而口咽深部的唾液试子以1000g离心1分钟，随后倒出。
EDTA抗凝血样本立即进行核酸提取。通过在室温下以2031g离心20分钟从天然血液样品中获得血清，并将其储存在70℃直至进一步使用。将组织样品等分并在70℃下储存。
2病毒检测
病毒DNA是在King Fisher 96 Flex仪器上（Thermo Scientific 赛默飞世尔）自动从所有试子、EDTA抗凝血样本和组织样本中提取的。
使用MagAttract®Virus Mini M48试剂盒（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）对拭子样本和EDTA抗凝血样本进行检测。使用TissueLyser II（QIAGEN®GmbH）在1ml无血清细胞培养基中均质化后，根据生产商的使用说明，用NucleoMag®VET试剂盒从MACHEREY-NAGEL（Du Ren，North Rhine-Westphalia，Germany）中提取组织样品用于病毒RNA / DNA分离。
使用Bio-Rad CFX 96实时检测系统（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）对所有核酸进行ASFV特异性实时荧光定量PCR (qPCR) 检测（参考King等(2003)）。此外，对恢复猪的器官样本用商品virotype ASFV进行实时荧光定量PCR （Qiagen Leipzig）检测。为排除其他病原，实验挑选了10头猪的全血样本用实时荧光定量PCR进行PRRSV，PRV病毒（猪疱疹病毒1型，SuHV1），FMDV，PCV2，CSFV，PEDV和甲型流感病毒（IAV）筛查 （Wernike, Hoffmann, & Beer, 2013, 略有改变）。
为了检测出血清和组织样本中的活ASF病毒，按照之前描述的方法（Pietschmann et al., 2015），用标准程序（Carrascosa, Bustos，& de Leon, 2011）进行血吸附试验（HAT）。简言之，将100μl血清/组织样品一式两份加入到接种于48孔微孔板（5×106个细胞/μl）的200μl外周血单核细胞衍生的巨噬细胞中，使其成熟3天。24小时后，将同源红细胞以1％稀释度加入无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（40μl/孔）中。随后，在2至4天的时间内分析培养物的血细胞吸附现象。
类似地，用血吸附试验读取病毒反滴定，通过稀释的接种病毒的终点滴定进行。为此，将100μl/病毒稀释步骤和20μl 1％同系物红细胞稀释液加入到接种于96孔微孔板（100μl/孔）中的成熟的外周血单核细胞衍生的巨噬细胞中。所有病毒稀释步骤都检测四次。
1血清学
采用INGEZIM PPA COMPAC ELISA (Ingenasa)检测所有血清样品中的ASFV p73特异性抗体。试验是根据生产商的说明进行的。
此外，通过中和试验（NPLA，中和过氧化物酶联抗体试验）筛查选定的血清样本，以确定它们对来自成熟外周血单核细胞的巨噬细胞上不同的试验病毒（ASFV荷兰86株和亚美尼亚08株）的中和能力。每一种测试病毒分别应用于经反滴定验证的两个接种滴度中，荷兰86株用于100和400 HAU，亚美尼亚08株用于10和100 HAU。从表现出高度不同的临床进程、ELISA抗体、qPCR和血吸附试验结果的6头猪身上采集血清样本，这6头猪的表现高度不一，有的临床表现为急性致死，ELISA为阴性或弱阳性，病毒检测结果为强阳性，有的临床表现为急性短暂，ELISA为强阳性，但所有的病毒检测均为阴性。所有使用的血清样本在使用前于56℃下热灭活2小时。这些检测均用上述的血吸附试验进行读数。
1临床症状和病理发现
潜在的‘带毒猪/C猪’在实验感染后表现出的临床症状和病程范围非常广，从急性致死到延迟致死，再到完全的临床恢复。表1和表S1概述了不同的病程、死亡时间点以及主要的临床和病理结果。
表1：临床病程、表现和病理结果汇总
上表为实验感染后的临床病程，包括猪的数量和死亡时间。根据本表所示的猪的临床和病理形态学特征，将猪分为不同的临床病程。括号里的‘1头’表示所有分配到该临床病程的猪中有1头在上述时间点死亡。感染后91天内ASFV特异性qPCR呈阴性的视为‘早期病毒清除’，91天后的视为‘晚期病毒清除’。
总的来说，所有接种的猪都出现了包括发烧在内的临床症状。然而，有些猪更有可能是通过与同栏中的病猪接触而感染的（见表S1），因为它们出现发烧的时间较晚，并且在很长一段时间的诊断测试中呈阴性。关于临床评分、发热以及死亡情况的详细信息见表S1。大多数的猪，在接种后4-6天就首次出现临床评分和体温升高，最晚的是接种后24天。图1和表S1描述了个体的发病、持续时间和发热情况。在这一急性期，以萎靡不振、结膜炎、食欲不振、皮肤发红（尤其是耳朵和眼睛周围）、扎堆、顽固性便秘、举止和步态问题为主要临床症状，并伴有中度至高热（高达41.8°C）（见图S1）。其中一头猪在发烧5天后出现中枢神经紊乱，不得不实施安乐死。急性期平均每头猪持续8-10天（4-19天不等），临床评分最大值为7-14分（见图S1）。此间，3头猪死于感染，其中2头死于第16天，1头死于第17天。这些病程被认为是急性致死的，主要的病理形态学发现包括几个器官的出血、外周淋巴结肿大出血（尤其是胃肝和肾），肾脏有瘀点，肺水肿。
图1：接种后0-40天内，每一头猪（no）和每一组（gr）猪的直肠体温变化。绿色表示无发热(<40°C)，不同色度的红色表示体温不同程度的升高，深灰色表示猪死亡。
之后，观察到临床症状和发热总体下降，只有5头猪在疾病后期偶尔又出现这些症状。在临床恢复的同时，许多猪出现了瘀点样病变和发绀区，或呈点状（特别是在耳朵或肛门生殖器区域），或呈广泛的地图状（几乎覆盖全身）。这些症状在接种13天后开始持续几天，并在19天达到高峰（40.7%受影响的猪）。在急性发热期之后，存活的猪中只有两头没有出现短暂的恢复。这两头猪（表1中的“慢性”）在接种后表现出早期临床症状（接种后4-5天）。尽管发热持续时间不同，但都在很长一段时间内表现出临床症状。主要症状包括厌食、消瘦、胃肠道症状（呕吐、血性腹泻、严重消瘦、生长阻滞和多发性关节炎，可能与关节发绀或四肢皮肤溃疡坏死有关）。其中一头猪接种后34天已经恢复，另一头猪在28天时被安乐死（编号76）。在对76号猪进行剖检时，发现数个出血、肿大和脓肿的淋巴结，间质性肺炎和腹水。恢复的那一头猪（标号66）在第128天剖检时，发现有下颌淋巴结脓肿，肾梗死（旧伤，右侧）和右侧跗骨关节周围组织水肿。
临时恢复阶段之后，临床评分在接种后第21到34天达到第二个高峰（5.5-14）。在此期间，6头猪（编号83、65、70、63、86、74）突发呼吸道问题（呼吸急促和困难）并于1-3天内死亡，并伴有明显的黄疸（全身皮肤和粘膜），但大多数猪没有发烧（表1中的“延迟致死”）。大部分猪（54.2%）在第27天受到影响。延迟致死猪的主要病理发现包括严重的肺泡水肿、肺出血、大范围黄疸、和多个体腔的积液。
临床评分与发热变化、皮肤瘀斑/发绀和呼吸症状开始节点的时间关系如图2所示。
哨兵猪（S猪）没有观察到有临床症状或病理形态学变化。
试验期间，3头C猪和1头S猪因为非相关的原因被安乐死。这些原因包括：肢蹄受伤（关节炎、腱鞘炎）和因等级秩序打架而受伤（接种86天时有1头C猪，128天时有1头C猪，135天时有1头S猪）。这些猪在剖检时没有相关病理发现。
图2：接种后0-90天，实验感染猪（C猪）EDTA抗血清样本中ASFV特异qPCR结果的组均值（“MV”）。结果显示为45-Cq值。误差条表示标准差。均值来自所有qPCR阳性的猪在每个时间点的值。qPCR阳性猪的总百分比[%]见顶部（“[%]阳性率”）。
2病原检测
接种前，所有猪的ASFV特异qPCR检测和血吸附试验（HAT）结果均为阴性。对攻毒病毒的反滴定证实了攻毒滴度为每头猪2 × 104HAU。
在试验过程中，在所有实验感染猪的血液样本中均发现了非洲猪瘟病毒基因组和活病毒。除了7头猪在出现临床症状之前就检测到非洲猪瘟病毒基因组外，其他猪的EDTA抗凝血样本第一次个体qPCR阳性结果主要与临床症状/发热的出现有关。接种后91天内全血样本中ASFV基因组的qPCR检测情况以及每个时间点阳性猪的比例见图2。首批阳性结果在3-21天检测到。从第3天开始，qPCR阳性猪的数量稳步增加，直到29天时所有猪都出现阳性结果。在10和14天时检测到最高的基因组载量，最大Cq值为18-19。在第29天，Cq值下降了6，在第42 dpi时，6头猪首次出现qPCR阴性结果，48天达到7头，63天达到10头。91 天后，52%的C猪qPCR结果仍为阳性，且基因组载量下降(cq28 - 30)。检测时间如表1所示。
总体来说，血吸附试验在血清中首次检测到ASFV与全血的qPCR结果一致（见图3），但有4头猪例外，它们血吸附试验较早检出阳性，其中有1头猪在首次血吸附试验阳性结果出现前就出现qPCR阳性结果。在第14天，30头猪中有28头的血吸附试验检测结果呈阳性。与qPCR结果相反，首次血吸附试验阴性结果出现在第29天（2头猪）。随后，血吸附试验阳性样本量迅速下降，直到从第63天开始所有存活的猪呈阴性（见图3）。
图3：qPCR检测ASFV基因组与血液吸附试验（HAT）分离活ASF病毒的结果比较。在相应的试验中，阳性结果的动物总数以每个时间点上所有存活猪的百分比表示。两种方法均以血样为基础：EDTA抗凝血样用于ASFV特异性qPCR和血清样本用于血吸附试验。
未完待续~
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本文由猪译官蔚飞翻译，猪译馆享有中文版权，转载请注明来源。
