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  非洲猪瘟持续成为全球养猪业的关注重点，但导致该疾病长期存在的因素及其传播动力学还远未得到了解。一直以来，临床康复猪被认为是疾病长期存在的重要原因之一，这些猪被称为“沉默的携带者”（Allaway, Chinombo, Edelsten, Hutchings, & Sumption, 1995; Boinas, Hutchings, Dixon, & Wilkinson, 2004; Sanchez-Vizcaino, Mur, & Martinez-Lopez, 2012）。然而，针对评估ASF带毒状态的报告非常少，而且常常是高度矛盾的。由于对幸存动物的长期实验代价高昂，并且极难进行，因此这方面的数据极其有限。

  本文整理了来自德国因塞尔里姆斯弗里德里希-洛弗勒研究所的一份针对猪ASFV带毒状态的研究报告，实验用了36头猪，历时165天，得到了一个明确的结果：阴性哨兵猪与实验感染猪在感染后99天混栏没有转阳，实验感染存活的猪组织中也没有分离到病毒，表明存活下来的感染猪并不会长期带毒，而是随着时间的推移，病毒载量逐渐降低，并最后完全清除病毒。这一结果也与之前的几项研究结果一致。

猪感染非洲猪瘟后能带毒多久？（下）

病原检测

  在每只实验感染的猪的各种拭子样本中，均观察到了不同程度的散毒情况，如图4所示。标准口腔试子样本（OPF）在第3天（2头猪）首次显示弱阳性qPCR结果。在第7和10天，大多数OPF呈阳性，Cq值在30到41之间（平均34-36）。阳性试子总数从第14天开始下降，到第21天和第29天只有一个样品呈阳性。所有OPF在第42天都呈阴性（参见图4）。口咽样本（salivettes）的情况与OPF的结果一致，在第7和10天达到弱阳性峰值，从第14天开始下降。然而，口咽样本的阳性结果更多，基因组载量更高（最大Cq值28）并且能检测到的时间更长（至接种后63天）（参见图4）。在粪试子样本中，qPCR结果相似，Cq值在第10天达到明显高峰（34），在第29天检测到最后一个阳性结果（见图4）。

  图4：接种后0-90天，所有实验感染猪的ASFV特异性qPCR拭子样本结果的总体平均值（MV）:粪拭子（MV faecal）、口咽浅表拭子（MV OPF）、口咽拭子（MV Salivette）。结果显示为45-Cq值。误差条表示标准差。均值来自所有qPCR阳性的猪在每个时间点的值。每种试子的qPCR阳性猪的总百分比[%]见顶部（“[%]阳性率”）。

  与C猪相反，所有S猪在整个试验过程中，包括器官在内的所有样本的qPCR和血吸附试验结果均呈阴性。

  在组织/器官样本中，ASFV只在死于感染的猪身上检测到（详见表2）。简而言之，EDTA抗凝血样本、脾和肺的基因组载量高度均一，而扁桃体和腮腺样本的病毒差异较大。除了2头猪外，其他几乎所有猪的下颌淋巴结都显示出高基因组载量。所有致命性病程的猪脾脏样本中都能分离出病毒。

  所有存活的C猪和所有S猪在血吸附试验和常规PCR (King et al., 2003)检测中均为阴性，其中包括1头S猪的胎儿脾脏样本。使用商品virotype ASFV PCR试剂盒，检测到几个淋巴结标本阳性，Cq值大于35。除了一个例外，其他对应的猪都很有可能是通过接触感染的。这些发现都没有检测到复制病毒。另外，用qPCR对10头猪进行了2.3.2所述的其他病原菌的筛查。这些猪是根据表现出的瘀点样病变和发绀区域挑选的。除ASFV外，均未检测出其他病原。

表2：致死病例中血样和组织样本的qPCR结果

   急性感染期（接种后16-34天）死于感染的猪的血液和组织样本ASFV特异性qPCR (Cq值)检测结果。每头猪都有各自的耳牌，并且按照死亡时间顺序在表中排列。死亡时间用接种后天数表示。

免疫应答

1.血清学

  在试验前，所有猪均经检测证明没有ASFV特异性抗体。之后，除1头最初感染的猪外，其余的猪在各自临床症状（包括发烧）出现后4-9天均可由ELISA在血清中检测到ASFV p73特异性抗体。如图5所示，第一次可疑（5）和阳性（13）结果出现在接种后第10天。随后，检测到阳性猪的数量和阻断值稳步增加（见图5），直到从第29天开始所有猪均为阳性（阻断值74%-98%）。所有C猪的定量结果持续升高，在第63天时达到99%-100%（见图5）。在试验结束时，所有存活猪依旧呈现阳性。

  在对成熟巨噬细胞进行的所有中和试验中，均未发现任何ELISA阳性样本的中和能力。用反滴定法验证了所选ASFV毒株的接种浓度。然而，在所有血清样本中，所有血吸附试验在每个稀释步骤中的感染孔都是相同的。在S猪中，整个试验过程中都未检测到ASFV p73特异性抗体。

2.讨论

  存活动物可能携带ASFV这一问题，即持续或慢性感染，从而导致明显健康的恢复动物持续或间歇性散毒并传播ASFV，是最有争议的一个讨论话题。因为有对感染的家猪全群扑杀的政策，因此这个问题对于工业化的生产来说可能看似不很严重，但是对野猪群来说，长期幸存猪的影响是极大的，因为它们会在群体内存在数月或数年之久。如果大量的幸存动物能保持病毒持久性/长期慢性存在，那么这些幸存的动物将是一个极大的、无法轻易消除风险因素。

  在过去，有人认为，除了慢性感染的猪外，那些从ASFV感染中恢复的猪也可能继续散毒甚至传播病毒（Wilkinson, 1984），并引起新的疫情爆发（Bech-Nielsen et al., 1995）。这对ASFV持续时间较长的地区影响尤其大，因为这些地区的死亡率会降低，因此存活率会升高（Allaway et al., 1995; Fasina et al., 2010;Owolodun et al., 2010; Thomson, 1985）。

  在此背景下，我们用一个可控的数据库和和相当数量的幸存猪（用I型中等毒力的ASFV进行实验感染而恢复的家猪）进行的研究就为这方面提供了缺失的数据。实验接种了30头接近成年的育肥猪，存活20头，其中的19头在接种99天后与6头哨兵猪混栏。

  实验持续了两个多月。结果非常明确：没有病毒传播。

  此外，所有组织样本都没有分离到病毒，这表明幸存的猪能够完全控制和消灭病毒。常规PCR也是阴性的，商品PCR试剂盒也只发现了很少量的基因组载量，并且这些结果差异很大。

  综上所述，这些结果并不能表明幸存猪是长期/慢性感染的带毒者。根据来自多米尼加共和国对于另一种中等毒力的ASFV毒株的报道（Hamdy & Dardiri, 1984），接种后120天与哨兵猪混合，红细胞吸附试验结果为阴性，但通过直接注射混合血液还是会导致易感动物感染，这不能完全排除我们试验中的病毒含量正好低于检测极限的可能性。然而，在没有蜱虫参与的流行病学情况下，直接的非肠道接种是几乎不可能的，而经口感染通常需要病毒滴度大于104 HAU (McVicar,1984)。通过肌肉注射/静脉注射感染易感动物所需的病毒滴度与通过口鼻感染易感动物所需的病毒滴度之比据报道为1:140.000，而通过非肠道途径感染易感动物所需的病毒滴度低于1 HAU (McVicar,1984)。即使我们取足以通过口鼻途径感染弱野猪仔猪的低滴度（10 HAU），这个滴度也远远高于检测极限（Pietschmann et al., 2015）。

  图5：接种后0-63天，使用INGEZIM PPA COMPAC ELISA (Ingenasa)检测所有感染组血清中ASFV p73特异性抗体应答的平均值(（“MV”）。结果用阻断率%表示。ELISA截止点以直线表示，条形线表示标准差。

 因为平行试验对家猪和野猪的结果很相似（如Pietschmann et al., 2015），因此就实验结果是否能有效适用于野猪群而言，我们不认为会与家猪有很大差异。另一点值得讨论的是毒株类型和毒力的影响。我们现有的数据体相当有限，可能需要额外信息。然而，爱沙尼亚II型毒株研究中幸存的野猪（Nurmoja et al., 2017）以及I型毒感染研究中幸存的野猪（Cossu et al.,1991, Bech-Nielsen et al., 1995）都没有将病毒传播给混合的哨兵。

  我们的实验设置中没有涉及的一个因素是免疫抑制。可能会有人说，混合应激会带来轻微的免疫抑制，但这并没有得到系统的评估。而应激和免疫抑制之前被认为可以重新激活表现健康的带毒毒体内的病毒（Hamdy & Dardiri,1984;Sanchez Botija,1982; Wilkinson, 1984），这一点应该在未来的试验中进一步研究。

  尽管如此，清除病毒也需要很长时间，从血液中清除需要>90天（尽管从第63天开始就检测不到活病毒了），因此，我们可以说病毒存留时间很长。鉴于ASFV被认为是安全地被包裹在红细胞膜中（Bastos et al., 2003; Gallardo et al., 2009），这些结果可能与猪红细胞的最大寿命是约65–85天有关（Liebich, 2003）。同样在蓝舌病毒感染中，与红细胞的关系导致长期可检测到该病毒（MacLachlan et al., 1994）。我们的结果也与de Carvalho Ferreira 等人在2012年在接种后70天的猪的血液中检测到荷兰86株基因组的研究结果一致。为了进一步研究隐藏在红细胞膜皱褶中的病毒动力学，未来可以用红细胞吸附实验对溶血样本进行检测。

  虽然区分“长期持续性”、“持续性感染”或“慢性感染”可能是一个科学问题，但这些对受影响地区的长期影响是不相同的。真正的漫长的持续感染可能意味着野猪群中几乎无法控制的局面，因为恢复的野猪就像流弹一样，而存在长期持续性感染但最终能清楚病毒的局面就意味着恢复的猪能造成的问题是有限的。

  但要知道的是，我们的研究持续时间更长（165天），结果也符合血液和深口咽拭子样本中ASFV的长期可检测性，最长可达70天。在一些淋巴结样本中检测到数量非常有限的病毒基因组这一问题可能需要进一步讨论，尽管没有分离到病毒，而且也仅是在感染时间可能较晚的动物中检测到。

  在风险评估方面，必须考虑到最坏的情况。如果野猪死于其他原因，那么尸体就可能成为易感动物的一个感染源。在这种情况下，我们必须考虑经口感染而不是非肠道途径。

  血清转化和抗体的作用和性质也是一个不断争论的问题。在我们的研究中，所有猪血清转化在临床发病后4-9天内都能检测到，只有1头猪由于中枢神经紊乱在4天内不得不进行安乐死。尽管ELISA的阻断率稳步上升到100%，但巨噬细胞培养物的中和试验无论是对目前流行的‘亚美尼亚08’株(II型)还是对同源分离株都没有发现中和能力。这与血清抗体和初乳抗体的转移可以提供相当高水平的保护的观察结果不同（Onisk et al., 1994; Schlafer, McVicar, & Mebus, 1984a; Schlafer, Mebus, & McVicar, 1984b）。此外，对减毒病毒和重组病毒的研究（Gomez-Puertas et al., 1995）发现了体外中和（审核人：Escribano, Galindo, & Alonso, 2013）。对这一点，大家须知我们的实验仅针对巨噬细胞培养物上的野毒进行的。本试验以一种诊断的方式寻找完全的体外中和，但不评估宿主的有益反应。然而，这与经典猪瘟病毒不同，经典猪瘟抗体能够诱导完全阻断，但ASFV并没有被明显阻断。

  总的来说，我们的研究表明，临床结果和可测量的抗体产量（至少对p73）没有很好的相关性。在此背景下，未来的研究必须不仅关注细胞反应，而且要关注其他抗原的反应。

结论

  总体来说，我们没有看到任何感染中等毒力的ASFV后仍然存活的猪存在带毒状态。血液中病毒基因组的长期可检测性不仅是一个风险，也是一个诊断的机会。在至少90天内，PCR将能够在受感染的猪身上检测出病毒。观察到的非典型临床和病理形态学病变说明了实验室分析在ASFV诊断中的迫切必要性，以及农场主和兽医需要提高认识的重要性。

致谢

THANKS

我们要感谢所有参与这项研究的动物护理人员和技术人员的出色工作。我们特别感谢Dr. Bernd Hoffmann在非常时期的采样。这项工作是弗里德里希-洛弗勒研究所跨学科ASF研究网络的一部分。

利益冲突——作者声明没有利益冲突 

声明

本文由猪译官蔚飞翻译，猪译馆享有中文版权，转载请注明来源。

 参考文献

Allaway, E. C., Chinombo, D. O., Edelsten, R. M., Hutchings, G. H., & Sumption, K. J. (1995). Serological study of pigs for antibody against African swine fever virus in two areas of southern Malawi. RevueScientifique et Technique, 14, 667–676. https://doi.org/10.20506/rst.14.3.864

Arias, M., & Sánchez-Vizcaíno, J. M. (2008). African swine fever eradication: The Spanish model. In: A. Morilla, K. J. Yoon & J. Zimmerman (Eds), TrendsinEmerging ViralInfectionsinSwine, pp. 133–139. Ames, IA: Iowa State Press.

Bastos, A. D., Penrith, M. L., Cruciere, C., Edrich, J. L., Hutchings, G., Roger, F., ... R Thomson, G. (2003). Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation. Archives of Virology, 148, 693–706. https://doi.org/10.1007/ s00705-002-0946-8

Bech-Nielsen, S., Fernandez, J., Martinez-Pereda, F., Espinosa, J., Perez Bonilla, Q., & Sanchez-Vizcaino, J. M. (1995). A case study of an outbreak of African swine fever in Spain. BritishVeterinaryJournal, 151, 203–214. https://doi.org/10.1016/S0007-1935(95)80012-3

Blome, S., Gabriel, C., Dietze, K., Breithaupt, A., & Beer, M. (2012). High virulence of African swine fever virus caucasus isolate in European wild boars of all ages. Emerging Infectious Diseases, 18, 708.

Boinas, F. S., Hutchings, G. H., Dixon, L. K., & Wilkinson, P. J. (2004). Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal. Journal of General Virology, 85, 2177–2187.https://doi.org/10.1099/vir.0.80058-0

Carrascosa, A. L., Bustos, M. J., & de Leon, P. (2011). Methods for growing and titrating African swine fever virus: Field and laboratory samples. Current Protocols in Cell Biology, 53, 26.14.1–26.14.25. https:// doi.org/10.1002/0471143030.cb2614s53

de Carvalho Ferreira, H. C., Backer, J. A., Weesendorp, E., Klinkenberg, D., Stegeman, J. A., & Loeffen, W. L. (2013). Transmission rate of African swine fever virus under experimental conditions. Veterinary microbiology, 165, 296–304.https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2013.03.026

de Carvalho Ferreira, H. C., Weesendorp, E., Elbers, A. R. W., Bouma, A., Quak, S., Stegeman, J. A., & Loeffen, W. L. A. (2012). African swine fever virus excretion patterns in persistently infected animals: A quantitative approach. Veterinary Microbiology, 160, 327–340. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2012.06.025

de Carvalho Ferreira, H. C., Weesendorp, E., Quak, S., Stegeman, J. A., & Loeffen, W. L. (2014). Suitability of faeces and tissue samples as a basis for non-invasive sampling for African swine fever in wild boar. Veterinary microbiology, 172, 449–454. https://doi.org/10.1016/j.vet mic.2014.06.016

Depner, D., Staubach, C., Probst, C., Globig, A., Blome, S., Dietze, K., . . Conraths, F. (2016). African Swine fever – epidemiological considerations and consequences for disease control. Tiera€rztlicheUmschau, Heft 3/2016, 71(3), 72–78.

Escribano, J. M., Galindo, I., & Alonso, C. (2013). Antibody-mediated neutralization of African swine fever virus: Myths and facts. VirusResearch, 173, 101–109. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2012.10.012

Fasina, F. O., Shamaki, D., Makinde, A. A., Lombin, L. H., Lazarus, D. D., Rufai, S. A., ... Gallardo, C. (2010). Surveillance for African swine fever in Nigeria, 2006-2009. Transboundary and EmergingDiseases, 57, 244–253.

Gabriel, C., Blome, S., Malogolovkin, A., Parilov, S., Kolbasov, D., Teifke, J. P., & Beer, M. (2011). Characterization of African Swine Fever virus caucasus isolate in European wild boars. Emerging Infectious Diseases, 17, 2342–2345.https://doi.org/10.3201/eid1712.110430

Gallardo, C., Reis, A., Kalema-Zikusoka, G., Malta, J., Soler, A., Blanco, E.,.. . Leit~ao, A. (2009). Recombinant antigen targets for serodiagnosis of African swine fever.Clinical and Vaccine Immunology, 16, 1012–1020. https://doi.org/10.1128/CVI.00408-08

Gallardo, C., Soler, A., Nieto, R., Cano, C., Pelayo, V., Sanchez, M. A., .. . Arias, M. (2015a). Experimental infection of domestic pigs with African swine fever virus Lithuania 2014 genotype II field isolate. Trans-boundary and Emerging Diseases, 64, 300–304. https://doi.org/10. 1111/tbed.12346

Gallardo, C., Soler, A., Nieto, R., Sanchez, M. A., Martins, C., Pelayo, V., .. . Arias, M. (2015b). Experimental transmission of African swine fever (ASF) low virulent isolate NH/P68 by surviving pigs. Trans- boundary and Emerging Diseases, 62, 612–622.https://doi.org/10. 1111/tbed.12431

Gomez-Puertas, P., Rodriguez, F., Ortega, A., Oviedo, J. M., Alonso, C., & Escribano, J. M. (1995). Improvement of African swine fever virus neutralization assay using recombinant viruses expressing chromogenic marker genes. Journal of Virological Methods, 55, 271–279.https://doi.org/10.1016/0166-0934(95)00055-Y

Guinat, C., Gubbins, S., Vergne, T., Gonzales, J. L., Dixon, L., & Pfeiffer, D. U. (2016).Experimental pig-to-pig transmission dynamics for African swine fever virus, Georgia 2007/1 strain. Epidemiology and infection, 144, 25–34. https://doi.org/10.1017/S0950268815000862

Hamdy, F. M., & Dardiri, A. H. (1984). Clinical and immunologic responses of pigs to African swine fever virus isolated from the Western Hemisphere. American Journal of VeterinaryResearch, 45, 711–714.

King, D. P., Reid, S. M., Hutchings, G. H., Grierson, S. S., Wilkinson, P. J., Dixon, L. K., .. . Drew, T. W. (2003). Development of a TaqMan PCRassay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus.Journal of Virological Methods, 107, 53–61. https://doi.org/10.1016/S0166-0934(02)00189-1

Laddomada, A., Patta, C., Oggiano, A., Caccia, A., Ruiu, A., Cossu, P., & Firinu, A. (1994). Epidemiology of classical swine fever in Sardinia: A serological survey of wild boar and comparison with African swine fever. Veterinary Record, 134, 183–187.https://doi.org/10.1136/vr.134.8.183

Liebich, H. G. (2003). Funktionelle Histologie der Hauss€augetiere: Lehrbuch und Farbatlas fu€r Studium und Praxis. Stuttgart: Schattauer.

MacLachlan, N. J., Nunamaker, R. A., Katz, J. B., Sawyer, M. M., Akita, G. Y., Osburn, B. I., & Tabachnick, W. J. (1994). Detection of bluetongue virus in the blood of inoculated calves: Comparison of virus isolation, PCR assay, and in vitro feeding of Culicoides variipennis. Archivesofvirology, 136, 1–8. https://doi.org/10.1007/BF01538812

McVicar, J. W. (1984). Quantitative aspects of the transmission of African swine fever. AmericanJournalofVeterinaryResearch, 45, 1535–1541.

Mittelholzer, C., Moser, C., Tratschin, J. D., & Hofmann, M. A. (2000). Analysis of classical swine fever virus replication kinetics allows differentiation of highly virulent from avirulent strains. Veterinary Microbiology, 74, 293–308. https://doi.org/10.1016/S0378-1135(00)00195-4

Mur, L., Igolkin, A., Varentsova, A., Pershin, A., Remyga, S., Shevchenko, I., .. . Sanchez-Vizcaino, J. M. (2014). Detection of African swine fever antibodies in experimental and field samples from the Russian federation: Implications for control. TransboundaryandEmergingDis-eases, 63, e436–e440.

Nurmoja, I., Petrov, A., Breidenstein, C., Zani, L., Forth, J. H., Beer, M., ... Blome, S. (2017). Biological characterization of African swine fever virus genotype II strains from north-eastern Estonia in European wild boar. Transboundary and Emerging Diseases, 64, 2034–2041. https:// doi.org/10.1111/tbed.12614

Onisk, D. V., Borca, M. V., Kutish, G., Kramer, E., Irusta, P., & Rock, D. L. (1994). Passively transferred African swine fever virus antibodies protect swine against lethal infection. Virology, 198, 350–354. https://doi.org/10.1006/viro.1994.1040

Owolodun, O. A., Yakubu, B., Antiabong, J. F., Ogedengbe, M. E., Luka, P. D., John Audu, B., ... Shamaki, D. (2010). Spatio-temporal dynamics of African swine fever outbreaks in Nigeria, 2002-2007. TransboundaryandEmergingDiseases, 57, 330–339. https://doi.org/10.1111/j. 1865-1682.2010.01153.x

Penrith, M. L. (2009). African swine fever. Onderstepoort Journal of Veteri- nary Research, 76, 91–95.

Perez, J., Fernandez, A. I., Sierra, M. A., Herraez, P., Fernandez, A., & Martin de las Mulas, J. (1998). Serological and immunohistochemical study of African swine fever in wild boar in Spain. Veterinary Record, 143, 136–139. https://doi.org/10.1136/vr.143.5.136

Pietschmann, J., Guinat, C., Beer, M., Pronin, V., Tauscher, K., Petrov, A., .. . Blome, S. (2015). Course and transmission characteristics of oral low-dose infection of domestic pigs and European wild boar with a Caucasian African swine fever virus isolate. Archives of virology, 160, 1657–1667. https://doi.org/10.1007/s00705-015-2430-2

Sanchez Botija, C. (1982). African swine fever. New developments. RevueScientifiqueetTechnique, 1, 1065–1094.

Sanchez-Vizcaino, J. M., Mur, L., & Martinez-Lopez, B. (2012). African swine fever: An epidemiological update. TransboundaryandEmergingDiseases, 59, 27–35. https://doi.org/10.1111/j.1865-1682.2011. 01293.x

Schlafer, D. H., McVicar, J. W., & Mebus, C. A. (1984a). African swine fever convalescent sows: Subsequent pregnancy and the effect of colostral antibody on challenge inoculation of their pigs. American Journal of Veterinary Research, 45, 1361–1366.

Schlafer, D. H., Mebus, C. A., & McVicar, J. W. (1984b). African swine fever in neonatal pigs: Passively acquired protection from colostrum or serum of recovered pigs. American Journal of VeterinaryResearch, 45, 1367–1372.

Takamatsu, H. D., Dixon, L.K., Alonso, C., Escribano, J.M., Martins, C., Revilla, Y., & Salas, M.L. 2011: Asfarviridae. Virus Taxonomy, pp. 153–162.

Terpstra, C., & Wensvoort, G. (1986). African swine fever in the Nether- lands. TijdschriftvoorDiergeneeskunde, 111(8), 389–392.

Thomson, G. R. (1985). The epidemiology of African swine fever: The role of free-living hosts in Africa. OnderstepoortJournalofVeterinaryResearch, 52, 201–209.

Wernike, K., Hoffmann, B., & Beer, M. (2013). Single-tube multiplexed molecular detection of endemic porcine viruses in combination with background screening for transboundary diseases. Journal ofClinicalMicrobiology, 51, 938–944.  https://doi.org/10.1128/JCM.02947-12

Wilkinson, P. J. (1984). The persistence of African swine fever in Africa and the Mediterranean.Preventive Veterinary Medicine, 2, 71–82. https://doi.org/10.1016/0167-5877(84)90050-3